Основные принципы технологии электрофореза

Технология электрофореза основана на основных принципах электрофореза и на нее влияют внутренние факторы электрофоретических частиц и внешние факторы электрического поля.
Основные принципы

В нормальных условиях молекулы материала обычно не имеют заряда, то есть количество положительных и отрицательных зарядов, которые они несут, одинаково, что свидетельствует об электронейтральности. Однако из-за собственной диссоциации или адсорбции на своей поверхности других заряженных частиц оно несет отрицательный или положительный заряд, и в электрическом поле вещество будет мигрировать к положительному или отрицательному электроду. Существует много типов заряженных материальных частиц, которые могут быть ионами или биологическими макромолекулами, такими как белки, нуклеиновые кислоты, вирусные частицы и даже органеллы.
Молекулы белка состоят из аминокислот, которые являются типичными амфотерными электролитами и в растворе могут диссоциировать на положительно заряженные аминогруппы (-NH3+) и отрицательно заряженные карбоксильные группы (-COO-). Характер заряда белковых молекул и величина заряда, которую они несут, зависят главным образом от их свойств, а также от ионной силы (ионной силы I) и pH раствора.
При определенном значении pH количество положительных и отрицательных зарядов белковых молекул точно равно, а суммарный заряд белковых молекул равен нулю. В это время pH раствора является изоэлектрической точкой (pI) белка.
При pH раствора = pI молекулы белка незаряжены и не движутся в электрическом поле;
Когда pH раствора > pI, молекулы белка заряжаются отрицательно и движутся к положительному электроду;
Когда pH раствора <pI, молекулы белка заряжаются положительно и движутся к отрицательному электроду.

Нуклеиновые кислоты подобны белкам и также являются амфотерными электролитами. Полинуклеотидные цепи молекул ДНК и РНК имеют как кислые фосфатные группы, так и щелочные основания, но поскольку кислотность фосфатной группы сильнее щелочности основания, в нейтральных или щелочных растворах молекулы нуклеиновых кислот обычно кажутся кислыми, несут отрицательные заряды. и мигрируют к положительному электроду в электрическом поле постоянного тока.

Влияющие факторы
Внутренние факторы
Скорость электрофореза связана с характеристиками самих частиц, такими как положительный и отрицательный заряд, размер и форма частиц, тенденция диссоциации, амфотерные свойства, степень гидратации и т. д. Вообще говоря, чем больше чистая заряд, который несет частица, тем меньше частица и чем ближе ее форма к сфере, тем быстрее частица движется в электрическом поле; в противном случае, тем медленнее он движется.
Вообще говоря, линейные двухцепочечные молекулы ДНК не имеют сложных конформаций, влияющих на скорость электрофореза. В гель-электрофорезе обычно используемый логарифм его относительной молекулярной массы обратно пропорционален скорости электрофореза; но на скорость электрофореза плазмидной ДНК сильно влияет пространственная конформация молекулы. Относительная скорость электрофореза плазмидной ДНК с одинаковой молекулярной массой составляет: тип с замкнутой петлей > линейный тип > тип с полуоткрытой петлей. Молекулы РНК представляют собой одиночные цепи с локальными двойными спиральными структурами, поэтому скорость электрофореза молекул РНК зависит не только от размера молекулы, но и главным образом от ее пространственной конформации.

Внешние факторы
1. Напряженность электрического поля. Чем больше напряженность электрического поля, тем больше сила электрического поля, действующая на заряженную частицу, и тем выше скорость плавания, и наоборот. По разнице напряженности электрического поля электрофорез можно разделить на две категории:
① Электрофорез при нормальном давлении (2 ~ 10 В/см): напряжение обычно составляет 100 ~ 500 В. Подходит для разделения макромолекул, таких как белки и нуклеиновые кислоты, время разделения относительно велико: от нескольких часов до нескольких дней.

② Высоковольтный электрофорез (50–200 В/см): обычно напряжение составляет 2000–10 000 В. В основном его используют для разделения небольших молекул, таких как аминокислоты, пептиды, нуклеотиды, сахара и т. д. Требуемое время электрофореза очень короткое, всего несколько минут.
2. Свойства раствора В основном включают pH электродного буфера и раствора образца, ионную силу и среднюю вязкость.
(1) pH раствора: во время электрофореза в качестве электродного раствора необходимо использовать буфер для поддержания стабильного pH раствора. pH раствора определяет степень диссоциации заряженных частиц; он также определяет количество зарядов, несущих вещество. Для амфотерных электролитов, таких как белки, аминокислоты и нуклеиновые кислоты, чем дальше pH буфера от pI разделяемого вещества, тем больший заряд несут частицы и тем выше скорость электрофореза; в противном случае, тем медленнее. Следовательно, выбор подходящего значения pH, при котором количество зарядов, несущих разделяемые вещества, будет относительно различным, способствует их разделению во время электрофореза. В большинстве электрофорезов белков используются барбитуратовые или борнокислотные буферы с pH от 8,2 до 8,8. В это время белки сыворотки обычно заряжены отрицательно.

Для электрофореза нуклеиновых кислот часто используется одна из следующих трех буферных систем: буфер TAE [трис-уксусная кислота-этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)], буфер TBE (трис-борная кислота) или буфер TPE (трис-фосфорная кислота). Молекулы ДНК в этих буферах заряжены отрицательно.

(2) Ионная сила раствора. Суммарная электрическая сила, создаваемая всеми типами ионов, называется ионной силой. Уровень ионной силы зависит от общего количества ионных зарядов и не имеет ничего общего с их свойствами. Чем выше ионная сила раствора, тем медленнее скорость плавания заряженных частиц; и наоборот, тем выше скорость плавания заряженных частиц. Причина в том, что заряженные частицы притягивают ионы с противоположными зарядами и собираются вокруг них, образуя ионную атмосферу. Ионная атмосфера уменьшает заряд частиц и увеличивает сопротивление движению частиц, тем самым снижая скорость электрофореза. Более того, если ионная сила слишком высока, тепло, выделяющееся при прохождении большого тока, может привести к испарению большого количества воды. Однако если ионная сила слишком низка, общая концентрация и буферная емкость буферного раствора будут снижаться, что затрудняет поддержание pH раствора, тем самым влияя на заряд частиц, что приводит к уменьшению тока. сильная диффузия и снижение электрофоретического разрешения. Во время электрофореза ионная сила раствора обычно составляет 0,02–0,20 моль/л.
(3) Вязкость раствора: Как упоминалось ранее, электрофоретическая подвижность частиц обратно пропорциональна вязкости среды раствора. Следовательно, если вязкость раствора слишком низкая или слишком высокая, это неизбежно повлияет на скорость электрофореза.
3. Электроосмос. В электрическом поле электроосмосом называется относительное движение раствора к твердой опорной среде. Когда носитель не является абсолютно инертным веществом, раствор вблизи носителя часто относительно заряжен и раствор движется, увлекая за собой частицы. Следовательно, кажущаяся скорость плавания заряженной частицы представляет собой векторную сумму скорости плавания самой частицы и скорости плавания частицы, уносимой раствором. Когда два направления совпадают, скорость плавания частицы увеличивается, а когда направления противоположны, скорость плавания частицы уменьшается.
4. Адсорбция. Поверхность носителя оказывает определенное адсорбционное воздействие на образец, что может удерживать разделяемое вещество и снижать скорость электрофореза, тем самым вызывая образование хвоста образца и снижая разрешение.

5. Джоулево тепло. Тепло, выделяющееся при прохождении тока во время электрофореза, называется Джоулевым теплом, и его величина пропорциональна квадрату силы тока. Джоулево тепло может повысить температуру буферного раствора, снизить вязкость среды, усилить движение молекул и снизить разрешение. Когда Джоулево тепло слишком велико, оно также сожжет фильтровальную бумагу, расплавит агарозный гель или сожжет опорную среду из полиакриламидного геля. Влияние теплового воздействия на электрофорез можно уменьшить, контролируя напряжение или ток, либо установив устройство охлаждения и отвода тепла.