Ключевые моменты проведения ИФА

Высококачественные реагенты, хорошее оборудование и правильная эксплуатация имеют решающее значение для получения точных и надежных результатов ИФА. Процедуры ИФА различаются в зависимости от используемого твердофазного носителя. Планшетный ИФА обычно используется в бытовых медицинских исследованиях. В данной статье будут описаны ключевые моменты каждого этапа процедуры планшетного ИФА. Для ИФА с использованием шариков, пробирок и магнитных шариков используется специализированное оборудование. Для каждого типа ИФА предусмотрены подробные инструкции. Строгое соблюдение этих инструкций обеспечит получение точных результатов.

Сбор и хранение образцов

Для ИФА можно использовать широкий спектр образцов. Биологические жидкости (например, сыворотка), секреты (слюна) и выделения (например, моча и кал) могут быть использованы для анализа на специфические антитела или антигены. Некоторые образцы можно исследовать напрямую (например, сыворотка и моча), в то время как другие требуют предварительной обработки (например, кал и некоторые секреты). В большинстве ИФА-тестов в качестве образца используется сыворотка крови. За исключением фибриногена и антикоагулянтов, плазма крови по составу близка к сыворотке. Образцы плазмы крови требуют использования антикоагулянта, в то время как образцы сыворотки крови могут быть получены после естественного свёртывания сыворотки и ретракции сгустка. За исключением особых случаев, сыворотка крови используется в качестве образца для исследований в медицинских лабораториях. Плазма и сыворотка крови могут быть использованы в ИФА-тестах в равной степени. Образцы сыворотки крови можно собирать обычными методами, но следует соблюдать осторожность, чтобы избежать гемолиза. Лизис эритроцитов приводит к высвобождению веществ с пероксидазной активностью. В ИФА-тестах с использованием пероксидазы хрена гемолизированные образцы могут усилить неспецифическое окрашивание.

Образцы сыворотки крови следует тестировать в свежем виде. Бактериальное загрязнение может привести к образованию эндогенной пероксидазы хрена, что также может приводить к ложноположительным реакциям. Длительное хранение в холодильнике может привести к полимеризации, что может усилить фон в непрямом ИФА-тесте.

Как правило, образцы сыворотки, исследованные в течение 5 дней, можно хранить при температуре 4°C; образцы, исследованные более недели, следует хранить на льду. После размораживания в замороженной сыворотке будут наблюдаться локальные концентрации белков и их неравномерное распределение. Тщательно и осторожно перемешайте, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Перемешайте, переворачивая образец, но избегайте интенсивного встряхивания в блендере. Мутные или осевшие образцы сыворотки следует центрифугировать или профильтровать для осветления перед тестированием. Повторное замораживание и размораживание может привести к снижению титра антител. Поэтому, если образцы сыворотки для тестирования антител необходимо хранить для нескольких тестов, их следует аликвотировать и хранить на льду. Сыворотку следует хранить асептически с момента сбора, можно добавить соответствующие консерванты.

Подготовка реагентов

Подготовьте реагенты, необходимые для эксперимента, в соответствии с инструкцией к набору. Дистиллированная или деионизированная вода, используемая в ИФА, включая воду для промывки, должна быть свежей и высокого качества. Буферы домашнего приготовления следует калибровать с помощью pH-метра. Реагенты, извлеченные из холодильника, следует остудить до комнатной температуры перед использованием. Неиспользованную часть набора следует незамедлительно вернуть в холодильник.

Добавление образца

ИФА обычно включает три этапа добавления образца: добавление образца, добавление конъюгата фермента и добавление субстрата. При добавлении образцов их следует помещать на дно лунок планшета для ИФА, избегая верхних стенок. Будьте осторожны, чтобы не разбрызгивать и не создавать пузырьков.

Образцы обычно добавляются с помощью микропипетки, внося предписанное количество в лунки. Наконечник пипетки следует каждый раз менять для предотвращения перекрестного загрязнения. Для добавления образцов также можно использовать одноразовые пластиковые пробирки. Для анализов (например, непрямого ИФА), требующих разбавленной сыворотки, разведите ее в пробирке до предписанного разведения перед добавлением образца. В качестве альтернативы, добавьте разбавитель в лунки, затем добавьте образец сыворотки и встряхивайте на микрошейкере в течение 1 минуты для перемешивания. При добавлении раствора конъюгата фермента и раствора субстрата можно использовать количественную многоканальную пипетку для ускорения процесса добавления.

Инкубация
В ИФА обычно происходят две реакции антиген-антитело: после добавления образца и после добавления конъюгата фермента. Для завершения реакции антиген-антитело требуются определённая температура и время. Этот процесс инкубации называется инкубацией. Некоторые называют его просто «инкубацией», что кажется неуместным в контексте ИФА.

ИФА — это твёрдофазный иммуноферментный анализ, в котором связывание антигена с антителом происходит только на твёрдой поверхности. Например, в методе «сэндвича» с антителами, когда образец добавляется в лунку планшета, не все присутствующие антигены имеют равные шансы связаться с твёрдой фазой. Только антиген в слое раствора, ближайшем к стенке лунки, контактирует с антителом напрямую. Это постепенный равновесный процесс, требующий диффузии для достижения конечной точки реакции. То же самое относится к связыванию меченного ферментом антитела, добавленного позднее, с антигеном на твёрдой фазе. Вот почему реакции ИФА всегда требуют определённого времени инкубации.

Обычно инкубационные температуры включают 43°C, 37°C, комнатную температуру и 4°C (температуру холодильника). 37°C — это обычно используемая температура инкубации в лаборатории, идеальная для большинства случаев связывания антиген-антитело. Эксперименты, проведённые при разработке методов ИФА для изучения кинетики реакций, показали, что образование продукта обычно достигает пика через один-два часа при 37°C для двух реакций антиген-антитело. Для ускорения реакции температуру можно повысить; некоторые эксперименты проводят при 43°C, но более высокие температуры не рекомендуются. Реакции антиген-антитело проходят более тщательно при 4°C. В радиоиммуноанализе реакции часто охлаждают в течение ночи для максимального осаждения. Однако в ИФА это обычно не используется, поскольку занимает слишком много времени.

Для сохранения тепла обычно используется водяная баня, за исключением некоторых приборов для ИФА, оснащённых специальным нагревательным блоком. Планшет для ИФА можно поместить в водяную баню так, чтобы дно касалось поверхности воды, для быстрого выравнивания температуры. Чтобы предотвратить испарение, планшет следует накрыть. В качестве альтернативы, лунки можно накрыть полиэтиленовой пленкой или пластиковой пленкой, позволяя планшету плавать на поверхности воды. При использовании инкубатора планшет для ИФА следует поместить во влажную камеру, изготовленную из материала с хорошей теплопроводностью, например, металла. На дно камеры следует положить влажную марлю, а планшет – сверху на влажную марлю. Увлажненную камеру следует предварительно нагреть до указанной температуры в инкубаторе, особенно при более низких температурах. Независимо от того, инкубируется ли она в водяной бане или в увлажненной камере, реакционные планшеты не следует складывать друг на друга для обеспечения быстрого выравнивания температуры. При инкубации при комнатной температуре рабочая температура должна строго соответствовать указанному диапазону. Стандартная комнатная температура составляет 20–25 °C, но конкретные операции можно контролировать в соответствии с инструкциями в инструкции. Во время инкубации при комнатной температуре планшет для ИФА можно просто положить на рабочий стол. Необходимо следить за тем, чтобы температура и время инкубации были указаны точно. Для этого один человек не должен тестировать более двух планшетов одновременно.